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自從Emily Whitehead帶來癌癥治愈新希望后，CAR-T細胞療法再次穩固了它免疫細胞療法領域的中心地位。繼諾華的CTL019之后，FDA在2017年公布Kite公司的Yescarta CAR-T免疫細胞療法成為FDA認證的第二個細胞治療藥物，目前FDA已經批準的CAR-T產品有6款。隨著全球范圍內生物細胞技術和產業快速發展，細胞治療及臨床轉化成為我國健康保障發展的重大課題，國內企業也在迅猛發展，除復興凱特和藥明巨諾以外，多家本土細胞治療公司的產品有望在未來1-2年內上市。

盡管近兩年細胞治療產品的細胞來源和種類不斷豐富，針對T細胞進行改造的細胞療法目前仍占據整個細胞治療行業的重要部分。而CAR-T細胞產品的制備流程十分復雜，涉及到單采采集，T細胞細胞分選激活，基因修飾，擴增培養，收獲凍存等多個步驟。其中T細胞的分選和激活是非常關鍵的一個工藝環節，關系著后續是否成功制備細胞產品。

CAR-T細胞療法生產工藝流程概覽

（圖片來源：諾華官網）

越來越多的文獻表明，T細胞分選在CAR-T細胞制備中非常重要，直接影響到CAR-T細胞的抗腫瘤活性。Juno的早期創始人Stanley R. Riddell曾發表報道：CD19 CAR–T cells of defined CD4+:CD8+ composition in adult B cell ALL patients（ClinicalTrials.gov #NCT01865617）。文章主要介紹了限定比例的CD19-CAR T細胞在29例難治/復發急性B淋巴細胞白血病患者中的臨床治療效果，其中27例（93%）患者實現了骨髓水平的緩解。他指出：“與來自未分選的T細胞相比，有特定亞群的T細胞產生的CAR-T細胞產品具有更好的抗腫瘤效應。“在2017年CDE發布的《嵌合抗原受體修飾T細胞（CAR-T）制劑制備質量管理規范》中也明確建議：”對采集的外周血進行單個核細胞的分離及T細胞的分化，并對所分選出的T細胞進行刺激和活化。”進行T細胞分選可以帶來如下好處：

目前針對T細胞的分選及激活主要有2種策略。一是以納米級別磁珠為基礎的分選，主要策略包括有CD4/CD8的分選或CD3的分選，聯合后續納米級別的CD3/CD28抗體激活試劑；二是以微米級別磁珠直接偶聯CD3/CD28抗體對T細胞進行分選及激活。

市場上納米級別磁珠的大小在50-500nm之間，分為有柱式分選和無柱式分選。無柱式分選操作簡單快捷，無需負擔分選柱的耗材成本。無柱式分選的納米級別磁珠大小在200-500nm，由于納米級別磁珠的磁力作用相對較弱，需要添加大量的磁珠抗體與細胞表面抗原結合，細胞才能被磁鐵吸附從而被分選出來。而過量的磁珠抗體標記可能對細胞的信號通路產生激活從而影響細胞功能，因此無柱式分選往往應用于陰性分選，即磁珠標記非目的細胞，通過磁分的方式將非目的細胞去除。另一方面，無柱式分選操作中存在開放操作步驟，如需應用到GMP生產，需要在A級環境進行操作。而有柱式分選，可通過分選柱結構有效增大磁場強度梯度，磁珠大小在50-100nm之間，少量的磁珠標記，細胞就可被分選出來，且無需對磁珠進行去除。借助于分選柱的密閉結構，可將整個磁珠分選的步驟在全密閉的自動化系統中完成，這也是目前CGT行業進行細胞分選的金標準之一。

T細胞的另一種激活分選策略則采用微米級別磁珠直接偶聯CD3/CD28抗體。以Dynabeads™為代表的4.5μm級別的激活磁珠也是目前T細胞激活的另一主流產品。微米級別磁珠具有更強的結合能力，更強的激活效果，可將T細胞的分選及激活步驟整合。且微米級別磁珠無需分選柱結構即可完成分選，節省了分選柱的耗材成本。但監管法規要求對微米級別磁珠在最終產品的殘留進行檢測，并達到相應標準，因此需要對激活擴增后的細胞進行磁珠去除的操作。

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